知禾提供基于流式分选技术（FACS）的酵母表面展示体系的文库高通量筛选技术平台，满足客户需要兼顾亲和力前置分级筛选的抗体开发要求。
知禾通过免疫双峰驼、羊驼（Alpaca）、小鼠等试验动物，提供纳米抗体和ScFv抗体定制服务。也可以针对特定抗体构建突变文库，筛选得到更高亲和力的抗体。可以设计完成靶点蛋白制备、动物免疫、酵母展示文库构建、磁珠及流式筛选、阳性抗体表达载体转换、阳性抗体与靶细胞结合验证等一站式解决方案，满足客户的全方位需求。
技术原理
酵母表面展示(yeast surface display, YSD)是一种将外源蛋白基因与酵母细胞表面蛋白基因融合，使外源蛋白表达并锚定在酵母细胞表面的真核展示系统。作为真核系统，能对展示的蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰，更易保证蛋白的天然构象和生物活性。以及酵母细胞易培养、操作简便。是目前广泛使用的细胞表面展示技术。与流式细胞分选相结合，筛选出与靶向抗原特异结合的抗体。
知禾的酵母表面展示技术采用“α-凝集素”展示系统，将纳米抗体基因序列和表达标签c-myc tag基因序列插入至蛋白质支架-Aga2基因的展示质粒载体中，该载体使用营养标记物在酵母中维持选择性生长，并通过培养基中加入半乳糖诱导酵母进行表面展示，纳米抗体融合蛋白被分泌并锚定在酵母细胞壁上。再结合磁珠及流式分选技术进行多轮筛选，可筛选得到高亲和力、高稳定性的克隆。
知禾通过免疫双峰驼、羊驼（Alpaca）、小鼠等试验动物，提供纳米抗体和ScFv抗体定制服务。也可以针对特定抗体构建突变文库，筛选得到更高亲和力的抗体。可以设计完成靶点蛋白制备、动物免疫、酵母展示文库构建、磁珠及流式筛选、阳性抗体表达载体转换、阳性抗体与靶细胞结合验证等一站式解决方案，满足客户的全方位需求。
服务流程与周期
步骤 | 服务内容 | 交付内容 | 周期 |
动物免疫 | l 动物免疫4针，加强免疫一针，共计免疫5针。 l 免疫前采集阴性血清。 l 从第3针开始采血，ELISA检测血清效价。 l 效价合格，采血分离PBMC。 | l 免疫动物PBMC。 l 效价检测结果。 | 5-8周 |
cDNA制备 | l PBMC总RNA提取。 l RT-PCR制备cDNA。 | l PBMC细胞。 l Total RNA。 l cDNA。 | 1-3天 |
文库构建 | l 以文库cDNA为模板，PCR法扩增抗体基因。 l 抗体基因拼接酵母展示载体，电击转化构建文库， 计算库容。 l 随机挑选克隆，PCR鉴定文库阳性率。 | l 文库随机测序结果。 l 酵母展示文库（库容108-109、文库插入率＞90%）。 | 2-3周 |
文库筛选 | l 3-5轮磁珠筛选及荧光标记蛋白FACS筛选。 l 挑取96个单克隆诱导表达，流式检测阳性克隆。 l 阳性克隆基因测序。 | l 各轮筛选结果。 l 单克隆与靶蛋白结合流式分析结果。 l 至少5个独特HCDR3的序列。 | 5-6周 |
载体转换 | l 阳性克隆构建转换为真核表达载体。 | l 转换至真核表达载体的阳性克隆菌种。 | 1周 |
细胞结合验证 | l 阳性克隆小量转染细胞表达。 l 小量表达抗体上清流式检测与靶细胞结合。 l 选择高结合的抗体克隆大量转染细胞表达。 l 大量表达抗体纯化、定量。 l 纯化后抗体流式检测与靶细胞结合EC50。 | l 纯度、浓度合格的纯化抗体。 l 小量表达抗体流式检测结果。 l 纯化抗体EC50流式检测结果。 | 3周 |
抗体亲和力测定 | l BLI检测抗体亲和力。 | l 检测结果。 | 1-2周 |
