杂交瘤技术简介

杂交瘤一般是指我们将骨髓瘤细胞和免疫B淋巴细胞进行融合，形成能分泌高度纯一单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术，由诺贝尔生理学或医学奖获得者Georges Kohler和Cesar Milstein于1975年发明。抗体是由免疫的B淋巴细胞分泌的球蛋白，各个淋巴细胞分泌的抗体各不相同，因而要获得一种独特的抗体只有从一个B淋巴细胞产生的细胞群制取。然而B淋巴细胞在体外不能长期存活，分裂2-3次即要死亡，因而无法得到由一个淋巴细胞的后代细胞群分泌的大量抗体。骨髓瘤细胞在体外培养条件下具有无限繁衍的特性，将免疫B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种杂交细胞遗传双亲细胞的特性，既能像B淋巴细胞一样分泌抗体，又能像骨髓瘤细胞一样无限增殖，这样我们就得到了能够在体外不断扩增同时分泌抗体的杂交瘤细胞。

杂交瘤技术基本流程

杂交瘤技术的基本流程主要包括：免疫抗原制备—动物免疫—细胞融合—杂交瘤细胞筛选—亚克隆及抗体特异性检测—抗体大量制备。

（1）免疫抗原制备

一般免疫抗原可选蛋白、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。

知禾同创特色：可根据客户要求定制靶点蛋白

（2）动物免疫

通常选用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射等。

常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原+弗氏不完全佐剂，皮下注射）、冲击免疫（抗原+弗氏不完全佐剂，腹腔注射）。

知禾同创特色：采用独特的水溶性免疫佐剂，5周即可达到常规佐剂免疫8周的同等效果，同时可为客户根据抗原的特性制定免疫方案。

（3）细胞融合

①骨髓瘤细胞制备：

骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，融合前骨髓瘤细胞应处于对数生长期，融合前培养不能少于1周；冻存复苏后的骨髓瘤细胞要生长2周才可达到适用于融合的状态。
②饲养细胞制备：

通常在融合前一天，采用小鼠腹腔巨噬细胞和正常脾细胞作为融合饲养层。饲养细胞释放生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件，此功能也可通过添加相应细胞因子代替；同时饲养细胞也可满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

③脾细胞制备：

小鼠处死前摘眼球取血，分离血清作为检测时的阳性对照。取免疫小鼠的脾脏，研磨、过滤、离心后可得脾细胞，通常每只免疫小鼠可得约1x108个脾细胞。

④细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（PEG）介导细胞融合、电融合。PEG是使相邻细胞质膜融合，形成具有两个或更多核的单细胞。电融合是通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比PEG更加有效，结果具有重现性。

知禾同创特色：采用高效电融合促进剂，一次融合最多100-200块96孔板

（4）杂交瘤细胞筛选

细胞融合是一个随机的物理学过程，融合后细胞将以多种形式出现。因此要利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，HAT培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)。

正常细胞的核苷酸合成有两个途径：全合成途径和补救合成途径。全合成途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，该过程会被A阻断；补救合成途径是在H和T存在的情况下，经过次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化合成核苷酸，进而合成DNA，而所用的骨髓瘤细胞缺乏HGPRT而不能通过补救合成途径合成DNA，使得骨髓瘤细胞不能在该培养基中生长。正常的脾细胞在培养基中仅能存活5-7天，无需特别筛选，因此只有融合的杂交瘤细胞，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。培养7-10天后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞群。

（5）杂交瘤亚克隆及抗体特异性检测

将融合后抗体高分泌性的细胞群进行充分稀释，使克隆细胞数在0-0.5cell/孔之间，改用HT培养基培养后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞株，将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性单克隆细胞株，同时对所产生抗体进行流式检测、亲和力测定等相关检测，将定株细胞增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。

知禾同创特色：使用无血清细胞冻存液冻存候选克隆，延长检测周期。

（6）单克隆抗体大量制备

利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。

体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。

腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单。小鼠腹水中常伴有小鼠体内的各种杂蛋白，因此需要纯化后进行使用，同时也可能会有污染动物病毒的危险。

知禾同创特色服务：钓基因——因杂交瘤细胞大多数都不够稳定，且窗口期较短，不少科研工作者都困扰于筛选结果出来了，但是细胞却已经丢失抗体分泌能力，甚至死亡。

知禾采用小鼠抗体引物，克隆小鼠抗体可变区和恒定区基因，可以永久保留单克隆抗体基因序列信息，为后续专利保护、构建基因工程抗体、抗体人源化打下基础。

知禾拥有多样化的杂交瘤细胞抗体基因测序方案和丰富的测序经验，目前已累计交付1000+测序订单。