一、噬菌体展示抗体库技术概述
单抗的制备方法和技术主要包括免疫血清提取法、杂交瘤技术、单个B淋巴细胞抗体制备技术和噬菌体抗体库技术等。在上一篇文章中，我们主要讲述了关于杂交瘤技术的简介和关键点，本篇文章旨在介绍噬菌体抗体库技术。
简介
噬菌体展示抗体库技术(phage display antibody library technology, PDAT)是一种新型的单克隆抗体制备技术，是一种基于噬菌体展示技术(phage display technology, PDT)的抗体制备技术。
PDT是由美国生物学家Smith于1985年发明，他通过将外源基因序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，使外源蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达，并展示在子代噬菌体的表面。PDT突破性地在体外建立了蛋白表型与其遗传信息的直接联系，并保持了蛋白的空间结构和生物学活性。
PDAT能够在体外模拟体内的抗体生成过程，在体外进行试验并灵活筛选，可以不经杂交瘤途径，甚至不经过免疫就可以制备和生产单克隆抗体，是一种强大的用于制备全人源抗体的技术手段。其制备抗体不依赖于体内的免疫反应，可用于发现针对几乎所有类型抗原的抗体，并且结合了PDT表达蛋白基因型和表型的统一的特点，通过表型筛选就能得到相应的基因，是制备单克隆抗体领域中继B细胞杂交瘤技术后的又一次飞跃。而且相较于其它单克隆抗体的制备技术，PDAT具有抗体生产操作简单、周期短、抗体结构可塑性强、应用范围广、制备数量多、抗体产量大、多样性高和可直接生产人源化抗体等优点。
基本原理
PDAT的基本原理是将免疫球蛋白可变区VH、VL基因重组后整合在噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式将抗体表达到噬菌体表面，再利用这些新噬菌体颗粒感染大肠杆菌，噬菌体在菌体内组装，克隆基因与噬菌体的外壳蛋白基因一同表达在成熟噬菌体的表面，从而获得多样性抗体库。抗体库经过“吸附-洗脱-扩增”过程即可筛选获得到特异结合抗原的抗体分子及其基因序列。
类型
1、不同基因来源：
噬菌体展示抗体库可根据抗体基因序列的来源分为免疫抗体库和非免疫抗体库。
（1）免疫抗体库里的抗体基因主要来自于经抗原免疫的个体，采用经过免疫后的淋巴细胞内产生的IgG-mRNA直接建立抗体库，由于存在免疫偏好性，因此从该类抗体库中容易筛选出针对与某一特定抗原不同表位、具有不同特异性的高亲和力抗体克隆。因为在体内淋巴细胞已经过与抗原的亲和力选择，所以建立小容量的抗体库即可筛选出特异性强的高亲和力抗体。但是这种抗体库有着明显的缺点，即免疫个体本身就有限制性和偏好性，且只能产生针对特定抗原的特定抗体，其通量小，存在需要进行主动免疫的缺陷。
（2）非免疫抗体库可识别的抗原具有多样性，包括那些不引起机体免疫反应的弱抗原、自身抗原和具有毒性的抗原，理论上能够制备大量的多样性抗体。非免疫抗体库的特点是不针对特定的抗原，建立多样性强的抗体库，最大可能分离出高亲和力的抗体，一般又分为天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。
①天然抗体库是采用未经免疫的淋巴细胞建立的抗体库，可获得全部的抗体可变区序列，而且不易遗漏抗体基因，通常是利用未免疫者体内IgM-mRNA构建而成的，该抗体库可用于分离针对所有类型抗原的抗体，从天然抗体库中分离出的抗体亲和力主要取决于抗体库的多样性。
②半合成抗体库为人工合成一部分可变区，其余部分来自于天然抗体的合成抗体库。而全合成抗体库是指可变区都由人工合成的抗体库。
2、不同噬菌体展示系统：
噬菌体抗体库技术可以选择不同的噬菌体来进行抗体的展示，具体可分为T4、T7 、λ 噬菌体和丝状噬菌体展示系统等。
（1）T4噬菌体是肌病毒科的一种烈性噬菌体。结构相较于丝状噬菌体更为复杂，为二十面体结构，具有线性双链DNA。其衣壳蛋白中含有2种非必需外壳蛋白：小外衣壳蛋白(SOC)和高抗原外衣壳蛋白(HOC)，它们不影响噬菌体的正常活性因而可以作为外源基因的结合位点来展示外源蛋白。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示多种大小的多肽或蛋白质而很少受到限制，并且SOC和HOC蛋白拷贝数较多，可以进行多价展示。
（2）T7噬菌体是短尾病毒科的一种烈性噬菌体，是一种双链丝状DNA烈性噬菌体，成熟的噬菌体通过细胞裂解而释放，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广。在T7噬菌体展示系统中，用于展示多肽和蛋白的衣壳蛋白主要是gp10A和gp10B，其中gp10B蛋白位于噬菌体表面，用于噬菌体展示系统。T7噬菌体比起丝状噬菌体的增殖速度更快，可节省克隆和筛选的时间，广泛应用于筛选不同分子量、不同亲和力的蛋白质。
（3）λ噬菌体是长尾病毒科的一种温和噬菌体，具有线性双链DNA分子，与T4噬菌体相同为二十面体，主要进行裂解性生长和溶源性生长，λ 噬菌体中的GPD蛋白和PV尾蛋白常被用来展示多肽或蛋白。λ噬菌体在宿主细胞内完成装配，同样无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示的蛋白质范围极广。
（4）丝状噬菌体主要指具有感染革兰氏阴性菌能力的M13、Fd和F1噬菌体，其中M13噬菌体在噬菌体展示技术中应用最广泛。
M13噬菌体为一个丝状长管结构，一个环状单链DNA基因组编码5个外壳蛋白（ｐⅢ、ｐⅥ、ｐⅦ、ｐⅧ和ｐⅨ）以及6个组装和复制蛋白。大多数噬菌体展示系统基于外壳蛋白ｐⅢ蛋白与ｐⅧ蛋白。ｐⅧ是M13噬菌体上主要的外壳蛋白，可与6-7个氨基酸大小的外源蛋白融合表达。而ｐⅢ的拷贝数较低但可作为表达复杂结构的较大蛋白载体。由于丝状噬菌体的增殖为非裂解增殖，在增殖期间不会裂解宿主菌，因此该噬菌体在实验淘选过程中，只需将菌液离心后取上清并沉淀即可得到噬菌体，减少了因细胞裂解后需对噬菌体纯化的步骤，缩短了实验所需时间。
3、不同载体类型
噬菌体抗体库技术中常用的载体包括噬菌体载体和噬菌粒载体。
（1）噬菌体载体是基因工程中常用的载体，将外源基因替代或插入到噬菌体基因组当中，组成噬菌体载体。大多数噬菌体载体表面有多个蛋白展示位点，通常为多价展示。一般情况下，多价展示会使弱结合性克隆显示出假阳性，不易筛选特异性高的克隆，但在利用噬菌体展示多肽时，由于多肽与抗原的结合能力较弱，反而在多价展示的情况下更有益于筛选到目的克隆。相反单价展示可以提高筛选到高亲和力克隆的可能性，因此人们选择利用噬菌粒作为载体，通过单价展示进行高亲和力的筛选。
（2）噬菌粒是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒，是一类人工构建的含有丝状噬菌体包装序列、复制子，以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体，兼具丝状噬菌体与质粒的优点。噬菌粒具有基因组较小可插入较大片段、复制型为双链DNA、易于操作、转化效率高和产生的重组子更加稳定等优点。但由于噬菌粒本身不含噬菌体蛋白编码基因，导致噬菌粒不能独立合成单链DNA，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体，感染时要用辅助噬菌体，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白可将丝状噬菌粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，且能再次感染大肠杆菌而繁殖。
4、不同抗体类型
传统的全抗体由于分子量较大，不易于展示在噬菌体表面，因此噬菌体抗体库技术主要用于制备scFv、Fab、二硫键稳定性抗体(DsFv)、双链抗体(diabody)或小抗体(minibody)等（图1）。
（1）scFv是利用基因工程的方法将抗体的VH与VL通过一段15−25个氨基酸的linker连接构成的重组蛋白，是具有抗体活性的最小功能结构单位，其分子量约为完整抗体分子的1/6。scFv的优势是分子量小、穿透力强，但容易形成聚体，构建成完整分子后亲和力可能会缺失。
（2）Fab是一种完整抗体的片段，由VH与重链恒定区CH1以及一条完整的轻链即VL与轻链恒定区CL组成，二者之间由一个链间二硫键连接，形成异二聚体，仅有一个完整的抗原结合位点，其分子量约为完整IgG分子的1/3。相较于scFv库，Fab的形式更接近于完整抗体，其稳定性更好，但其表达水平较低。
（3）DsFv是通过在VH和VL之间形成二硫键来稳定Fv片段。与scFv相比，DsFv的稳定性和亲和力更高，同时也具有scFv小分子的优势，在临床上具有很高的应用价值。
（4）双链抗体由2个交叉的单链抗体scFv组成，由于连接用的linker将每个轻链重链的可变区分隔开，所以只能形成二聚体。
（5）小抗体通过基因工程手段采用不同的linker把scFv的VH与IgG的重链恒定区CH3融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为小抗体。
二、噬菌体展示抗体库技术流程
使用噬菌体展示技术制备单克隆抗体的基本步骤包括：
1、从体外细胞中提取总RNA，细胞类型可选免疫后的动物脾细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞、末梢血淋巴细胞、骨髓淋巴细胞等。
2、反转录总RNA得到细胞的cDNA文库，利用PCR技术以相应引物从中扩增获得全套的可变区基因，包括重链可变区VH和轻链可变区VL基因，随机拼接VH和VL基因构建多样性的抗体基因库。
3、将抗体基因克隆至M13噬菌体表达载体噬菌粒上，通过电击方式转入大肠杆菌TG1感受态细胞中，并加入辅助噬菌体M13KO7侵染大肠杆菌，使得噬菌体在菌体内增殖扩增，最后组装成含有特定抗体或抗体片段基因，并能将抗体表达展示在表面的重组噬菌体库，根据丝状噬菌体特性，将菌液离心后取上清，并对上清中噬菌体进行沉淀即可得到针对某种抗原的初级噬菌体抗体库。
4、选择特定抗原作为靶点目标，对建立的初级抗体库通常进行2‒5轮重复的筛选。在筛选过程中有2个主要的步骤分别是淘选和单克隆鉴定。
（1）噬菌体的淘选
创建文库后，就可使用固定抗原进行抗原特异性噬菌体抗体的富集，这一步被称为噬菌体淘选。淘选分为吸附、洗涤、洗脱和扩增4个过程。
①吸附：需将抗原固定在固相载体上，加入噬菌体抗体库后，使得表达特异性抗体的噬菌体与抗原结合。
②洗涤：随着淘选轮数的增加，逐步减少抗原包被浓度、增大洗涤液中Tween20浓度或逐步增加洗涤次数，洗去不结合或结合较弱的噬菌体，筛选出亲和力更高的噬菌体。
③洗脱：洗去未结合或结合较弱的噬菌体后，需要洗脱与抗原结合的高亲和力噬菌体。最常用的例如胰酶、甘氨酸、柠檬酸等酸性或碱性缓冲液。但需注意要把洗脱噬菌体的pH值中和到８左右，以避免噬菌体降解或失去感染性。
④扩增：结合的噬菌体从靶标上洗脱回收，取少量噬菌体进行浓度滴定检测，用于后续根据投入产出比计算富集因子；部分重新感染大肠杆菌TG1并加入辅助噬菌体增殖，进行下一步淘选和浓缩；剩余部分冻存保种。
（2）单克隆鉴定
经过数轮淘选，与固定相特异性结合的噬菌体展示目的抗体被富集并分离出来，由于抗体的编码基因序列与噬菌体载体上的序列一一对应，所以几轮淘选后，将富集到的与抗原特异性结合的多克隆噬菌体进行单克隆化，即可从多克隆噬菌体中挑选出单克隆噬菌体。
挑选出的单克隆菌株转接至96孔板中，取其单克隆培养上清进行ELISA检测，根据结果可得到高特异性单克隆菌株，并通过测序手段获得由单克隆噬菌体展示的抗体基因。
通过噬菌体展示技术筛选单克隆抗体的过程省略了细胞融合过程中繁琐的步骤，也避免了因为杂交瘤细胞的不稳定性而需要进行反复亚克隆的过程。使得噬菌体抗体库技术成为了制备单克隆抗体的快速且高效的手段。
虽然从特定疾病的免疫抗体库中分离出的单克隆抗体相较之下具有更好的特异性，但由于技术和成本的影响，目前大多针对传染病的单克隆抗体仍然是通过天然抗体库分离而来。从实用性看，天然文库的无偏性更好，几乎可以筛选出针对所有靶分子的单克隆抗体。且可以重复利用于多种疾病的单克隆抗体的开发，不必为每个新疾病都重新建立免疫抗体库。尽管来源于天然文库的单克隆抗体特异性稍差，但相较时间和成本，其还是成为了目前使用噬菌体展示技术筛选单克隆抗体的一个普遍选择。
知禾提供预制了系列天然，合成及半合成人源，骆驼、羊驼抗体噬菌体展示库和多肽展示库，我们提供筛选服务。
