紧密连接（Tight Juctions, TJs）是细胞间粘附的一种形式，在细胞周围形成了连续的密封区域，构成了液体无法进入的实质屏障，对于调节细胞旁通透性和维持细胞极性至关重要（Capaldo,SEMIN.CELL.DEV.BIOL, 2015）。Claudin（CLDN）和JAM、occludin共同构成了紧密连接的结构核心。CLDN蛋白最早在1998年由科学家首次从鸡肝中分离（Mikio Furuse, J Cell Biol, 1998）。CLDN蛋白家族迄今已经鉴定了27个成员，CLDN6就是其中之一。

在许多种疾病中都发现CLDN蛋白表达和功能失调，包括癌症。CLDN6在胎儿组织中表达，而在正常的成人组织中表达水平低或不存在。CLDN6在多种癌症中高表达，尤其是睾丸癌、卵巢癌和非小细胞肺癌(Hewitt, BMC Cancer,2006)，这使得CLDNA6成为和CLDN18.2一样非常有前景的癌症治疗靶点。

目前，全球已有10多款药物，进入临床或临床前研究阶段，类型包括单抗、双抗、ADC、CAR-T和mRNA疫苗等。取了一定的进展的同时，也面临着挑战。安斯泰来的IMAB-027（单抗）进入临床Ⅱ期，未达到预期已经终止；Abbvie的SC004（ADC）在临床Ⅱ期观察到因结合CLDN9导致耐受剂量低已经终止。

CLDN蛋白是多跨膜蛋白，构象依赖，常规的重组蛋白并不能很好地还原构象，VLP（virus-like particle）、Nano disc等跨膜蛋白生产技术平台和真实构象虽然仍存在差距，但可以在一定程度上解决问题。

(CLDN6结构示意图，红点为与CLDN9不同的氨基酸)

CLDN6与CLDN3、CLDN4、CLDN9有同源性，CLDN6与CLDN9胞外域更是只有3个氨基酸不同，而其他这些同家族的蛋白在胰腺、肾脏、肠道等组织正常表达(Hewitt, BMC Cancer,2006)，存在脱靶风险，因此，对CLDN6抗体的特异性要求较高。

CLDN6在不同种属间也相对比较保守，人CLDN6与小鼠CLDN6总体序列同源性为88%，细胞外序列同源性为95%，细胞外残基仅有4个不同，使用小鼠作为免疫动物可能会存在免疫耐受，免疫反应较低，筛选到高亲和力抗体的概率难度较大。

2023年美国癌症研究协会(AACR)年会上，Context公布了其双抗药物CTIM-76（CD3×CLDN6）的临床前数据，据称其CLDN6臂表现出很高的CLDN6选择性，是CLDN9的千倍以上。

根据其合作公司发表的文章（Brad Screnci, iScience, 2022），他们使用DNA和VLP生产的脂质颗粒进行免疫，免疫宿主选择了母鸡。血清检测效价合格后，取其B细胞扩增抗体VH和VL基因，构建了ScFv噬菌体展示文库。使用CLDN6（脂质颗粒）进行淘选，并进行了CLDN9（脂质颗粒）的负淘选，对得到的ScFv进行流式细胞术鉴定是否与CLDN6结合，得到了159株克隆。选出TOP 40转化为IgG形式，验证其与CLDN6和CLDN9结合的差异，最终得到5株克隆，能够特异性地结合CLDN6，与CLDN9弱结合或不结合。对其中一株进行人源化和亲和力成熟，即是CTIM-76双抗的CLDN6臂。

在这一开发过程中，免疫宿主的选择十分关键，鸟类和哺乳动物之间存在进化差异，具有动物种系发生学距离优势，CLDN6同源性较低，可以绕过免疫耐受，更适于生产特异性抗体。利用噬菌体展示技术进行负淘选也是非常重要的设计，大大缩小了需要进行鉴定的范围。

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