白蛋白与脂肪酸、小分子、金属离子和其他几种蛋白质物理相互作用。与大量生物活性物质结合使其成为关键的转运分子。白蛋白还能清除对细胞存活有害的活性氧。这些特性使白蛋白成为促进细胞生长和在体外培养环境下维持各种真核细胞的绝佳选择。高质量的重组人白蛋白不含其他杂质和非天然修饰，加上无动物源的安全性，使其已经成为细胞和组织培养领域的完美选择。本文讨论了人血清白蛋白在体外条件下与细胞生长和存活有关的关键特征。
1 简介
几十年来，哺乳动物细胞培养在生命科学的进步中发挥了重要作用。血清尤其是胎牛血请（FBS）是真核细胞培养的关键成分。它提供了细胞在体外条件下所需生长所需的必需元素。FBS 的一个关键成分是牛血清白蛋白 (BSA)，它占血清蛋白质含量的 95% 以上，此外还含有少量其他蛋白质，包括胰岛素、激素和生长因子。作为一种必需的培养基成分，它支撑了各种细胞类型的生长和永久细胞系的发展。然而，作为一种生物制品，胎牛血清表现出显著的批次间差异。人们经常发现它受到支原体、病毒和朊病毒等病原体的污染，这些病原体会导致传染性海绵状脑病 (TSE)，因此，人们希望避免使用血清。如今，由于监管和质量控制的日益增加，重组蛋白已逐渐取代细胞培养基中的动物来源的血清和其他培养基辅料，如胰岛素、转铁蛋白和白蛋白。
白蛋白在细胞培养物中的作用主要取决于其抗氧化特性、毒素隔离特性和生物活性配体的运输。本文总结了重组人血清白蛋白（rHSA）在细胞培养应用的固有结构和生化特征。
2 白蛋白的结构和生化特征
人血清白蛋白是所有脊椎动物血浆中最丰富的蛋白质。它在肝脏中作为前白蛋白原合成，在内质网和高尔基体中成熟，然后从肝细胞分泌。HSA由 585 个氨基酸组成，分子量为 66,348 Da。HSA 是一种球状、心形蛋白质，具有一系列重复的六个螺旋子结构域。HSA 由 67% α螺旋、10%转角、23%随机卷曲组成，无 β 折叠。高分辨率 X 射线晶体学结构显示白蛋白中的三个主要结构域。它们通常编号为结构域 I (1–195 aa)、结构域 II (196–383 aa) 和结构域 III (384–585 aa) (图1）。每个结构域又分为两个子结构域，A 和 B。
HSA 与牛 (BSA)、马 (ESA)、兔动物 (LSA) 和犬类 (CSA)的对应物之间存在显着程度的序列和结构相似性以及表面电荷分布相似性。在序列水平上，HSA 和 BSA 具有 76% 的同一性。总体而言，各种来源的血清白蛋白具有超过 62% 的序列同一性。BSA晶体结构与HSA结构相比的均方根偏差（RMSD）为1.1 Å；对于 ESA 和 LSA，该值为 1.2 Å 。这种结构相似性是细胞培养实践中 HSA 可以被 BSA 或其他来源的白蛋白替代的主要原因之一。HSA、BSA 和 CSA 的分子动力学分析表明，结构域 I 和 III 的运动是定义白蛋白特性的关键。BSA 在结构上比 HSA 更刚性，而 CSA 更灵活，并拥有更大、更易与水接触的药物结合位点。
HSA有17个分子内二硫键，主要存在于α-螺旋之间，这些二硫键对蛋白质的稳定性至关重要。它还有一个游离的半胱氨酸残基（Cys-34），存在于结构域I中，在不同物种之间都很保守。该残基在纯化过程中通过形成分子间二硫键导致白蛋白二聚化。游离半胱氨酸残基位于约 10 Å 深的缝隙中，在白蛋白的氧化还原特性中发挥着关键作用，这在细胞培养中至关重要。Cys-34在体内和体外条件下与各种金属离子形成复合物并清除自由基。Cys-34 残基还参与清除自由基一氧化氮和其他活性氧 (ROS) 。它归因于活性氧通过清除ROS来防止脂质过氧化。此外，保守的组氨酸残基（His-3）也可作为清除活性氧的关键金属螯合剂。
图1 HSA的结构
图2 HSA的七个脂肪酸（FA）结合位点
3 重组人血清白蛋白
传统上，HSA 是通过分离人血浆进行商业生产的。然而，人体血浆的供应始终有限，不同来源的原材料质量不一致以及其他污染问题，导致最终纯化的白蛋白的质量和数量存在差异。
重组DNA技术在大规模生产高质量重组HSA方面发挥了至关重要的作用。酵母，特别是毕赤酵母，是 rHSA 生产最有前途的来源，可以轻松地放大细胞培养规模。酵母细胞提供多种翻译后修饰，例如蛋白剪切、折叠和二硫键形成，并且可以进行遗传操作以避免不需要的翻译后修饰。将蛋白质分泌到培养基中减少了下游纯化步骤的数量，使用一系列离子交换和疏水色谱树脂来纯化重组白蛋白以获得所需的纯度。
植物种子是重组白蛋白生产的另一种方法。转基因水稻可以将HSA表达在大米的胚乳中，产量可以达到米粒重量0.3%以上。
其他表达宿主也已用于rHSA表达和纯化，但由于工艺复杂，生产成本和表达宿主带来的蛋白修饰等原因，难以进行严格的质量控制，成为了实现重组 HSA 工业化生产的主要瓶颈。
4 白蛋白在培养基中的功能
4.1 结合脂肪酸
HSA 在血管系统中结合并携带脂肪酸。白蛋白是血浆中 99% 的非酯化脂肪酸 (FA) 的载体。白蛋白具有 7 个高亲和力和 20 多个低亲和力 FA 结合位点（图2）。
白蛋白的 FA 结合形式称为 B 形式（碱性形式）。当不含 FA 的 HSA 在不同 pH 值下经历可逆构象转变时，也观察到了这些形式。当 pH 值低于 3 时，HSA 具有扩展构象。在 pH 3 至 4.3 之间，HSA 呈现快速迁移 (F) 形式，其特征是粘度增加和溶解度降低。在 pH 4.3 和 8.0 之间，N 型由特征性的心形结构表示（图1）。当 pH 值大于 8.0 时，HSA 以 B 型形式存在。从 N 形式到 B 形式的转变的特点是分子内的域旋转；特别是域 I 和 III 似乎围绕靠近域 II 界面的点旋转。由于 FA 结合，最远端的子结构域显示出最显着的位置偏差。
来自不同物种（例如人、牛和马）的白蛋白结构相似，FA 结合位点内的氨基酸组成也相似。在真核细胞培养系统中，培养基中存在的白蛋白与 FA 结合，使其循环，这有助于促进细胞对 FA 的摄取。
4.2 结合金属离子
金属离子对于细胞的生长和发育至关重要。HSA 是等离子体中关键金属离子 Cu 2+和 Zn 2+的关键转运蛋白 。此外，铜等金属离子会发生单价氧化还原反应，催化自由基的形成。体内和体外条件均表明，金属离子的潜在毒性活性可通过白蛋白结合而减轻。白蛋白有四个金属结合位点，具有部分选择性的金属亲和力偏好 。
N 末端金属结合位点 (NTS)
第一个金属结合位点包含蛋白质 N 末端的前三个残基（HSA 中的 Asp-Ala- His 。这些残基、N 端胺和 His-3 残基之间肽键的氮原子与 Cu 2+和Ni 2+金属离子以方形平面配体排列方式配位。Cu 2+以高亲和力与白蛋白结合，HSA-Cu 2+复合物的解离常数为 6.7 × 10 -17 M.。His-3 残基被认为对于 Cu 2+的高亲和力结合至关重要。His-3 在除狗和猪白蛋白之外的哺乳动物中高度保守。它们的 His-3 被 Tyr-3 取代，导致这些物种对铜毒性的敏感性更高。Ni 2+对NTS的亲和力相对较低，解离常数值为2.5 × 10 -10 M。Co 2+离子也与NTS结合，解离常数为1 × 10 -4 M 。NTS 具有高度灵活的构象，因为即使在白蛋白的高分辨率晶体结构中也观察不到它。
Cys-34 金属结合位点
第二个金属结合位点存在于还原的 Cys-34 残基处。它是 HSA 中唯一不与另一个半胱氨酸配对形成分子内二硫键的半胱氨酸残基。二硫键模式在所有脊椎动物白蛋白中都高度保守，具有 17 个二硫键和一个游离硫醇半胱氨酸残基。还原形式的 HSA 具有 Cys-34 的游离硫醇。然而，该氨基酸残基往往会与其他半胱氨酸形成异源二硫键，导致蛋白质二聚化。Cys-34 位于子结构域 IA 的螺旋 2 和 3 之间的裂缝中，这导致金属离子相互作用的可及性有限和高度特异性 。Ag +、Au +、Hg 2+、Pt 2+和 Fe 2+金属离子特异性结合 Cys-34 。Ag +与 Cys-34 结合时测得的解离常数为 1 × 10 -5 M 。
多金属结合位点 A 和 B (MBS-A、-B)
MBS-A 存在于结构域 I 和 II 的界面处。MBS-A 和 MBS-B 也称为初级和次级镉结合位点，因为 Cd 2+是 NMR 研究中与这些位点相关的第一个金属离子 。定点诱变研究表明，结构域 I 中存在的 His-67 对于MBS-A 的Cd 2+结合至关重要。MBS-A 和-B 处Cd 2+结合的解离常数为5.0 × 10 -6 M 。Zn 2+结合的解离常数为2 × 10 -5 M 。现在有充分证据表明，Zn 2+离子主要结合在 MBS-A 上以诱导协同变构 。FA1、FA2 和 FA7 结合位点围绕 MBS-A，表明 FA 负载量显着影响金属离子对 MBS-A 的亲和力 。MBS-A还与Cu 2+和Ni 2+结合。多金属结合位点 B (MBS-B) 是第四个也是最后一个金属结合位点。该位点主要与 Cd 2+离子相关。MBS-B 上参与 Cd 2+结合的氨基酸尚不清楚。该位点可能具有更高程度的灵活性，从而产生多种构象；因此，它还没有被 X 射线晶体学或其他结构方法可靠地表征。最近，Co 2+离子也被证明与 MSB-B 相关。
金属离子的毒性作用可能不利于细胞生长，然而，一些金属离子是有效细胞生长所必需的，因为它们充当关键生物途径中涉及的几种酶的辅助因子。白蛋白具有与各种金属离子相互作用的能力，在这两种情况下都可以发挥双重作用。一些金属离子，例如钒（与药物结合位点1 结合）和硒（与二硫键结合）对于体内和体外条件下的细胞生长至关重要。白蛋白与这些微量元素协调并确保它们的运输以实现最佳的细胞生长和存活。
4.3 HSA的抗氧化特性
HSA 的抗氧化活性主要归因于四个主要金属结合位点的氧化还原特性。游离的Cu +、Fe 2+和其他金属离子与氧反应生成ROS ，它们还可以与H2O2相互作用产生有害的羟基自由基。另一方面，白蛋白与金属离子的结合限制了这些离子参与ROS生成的能力。
在生物反应器中进行的工业规模真核细胞培养物含有溶解氧和游离金属，如铁、铜、钴和镍，产生的 ROS 会降解细胞膜 。添加 BSA 或 HSA 可降低 ROS 压力，从而实现健康的细胞培养。另一方面，白蛋白与这些金属，特别是铜、锌、钒和硒的结合，促进细胞对这些金属的吸收，刺激培养物生长并显着提高真核细胞中重组蛋白的产量。
4.4 结合吡哆醛和核黄素
氨基酸是细胞培养基的关键成分。任何细胞培养基组合物都包含细胞有效翻译蛋白质所需的必需氨基酸，确保最佳的细胞生长、存活和细胞分裂。吡哆醛及其衍生物5'磷酸吡哆醛（PLP）与游离氨基酸，尤其是赖氨酸和精氨酸反应，形成希夫碱，这些希夫碱非常不稳定。当与金属离子接触时，它们会导致氨基酸降解，细胞生长抑制。游离的吡哆醛部分通过与白蛋白结合而被隔离。PLP 与 HSA 的 Lys-190 形成席夫碱 。HSA 通过防止 PLP 降解来稳定 PLP 。它从细胞培养基中去除游离的 PLP 污染物，阻止 PLP-氨基酸复合物的形成。
核黄素是另一个可以与游离氨基酸发生反应并降解它们的因子。它充当光敏剂并氧化细胞培养基中存在的游离氨基酸，例如色氨酸。核黄素-氨基酸复合物的光产物被称为发光色素。这种发光色素的形成导致核黄素结合氨基酸的快速降解。白蛋白可稳定光反应性核黄素。它向核黄素提供一个电子，产生还原的非活性加合物。通过这样，白蛋白结合细胞培养基中的游离核黄素，消除氨基酸降解。
5 HSA 的化学修饰
白蛋白经历多种翻译后修饰，影响配体结合和蛋白质的其他活性。这些化学修饰包括乙酰化、糖基化、糖化、亚硝基化、氧化、羰基化、磷酸化和氯化。在这里，我们仅讨论影响白蛋白作为细胞培养物添加剂的功能的基本修饰。当碱性残基的氨基与糖羰基形成席夫碱时，就会发生白蛋白糖化。Arg410 和 Lys 525 是 HSA 中的糖化热点。糖化后，白蛋白显示出由二级和三级结构损失引起的蛋白质构象的显着变化。糖化会触发关键残基（例如 His 和 Trp）的修饰，正如通过蛋白质内在荧光的损失所观察到的那样。这些修饰也会损害白蛋白的抗氧化特性。研究表明，白蛋白上只要有一个甘氨酰基就会引起毒性。因此，从血浆或异源重组蛋白中纯化白蛋白的过程应避免白蛋白糖化。
Cys34 是另一个化学修饰热点。Cys34 的 S-亚硝基化改变了其金属结合特性。Cys34 氧化导致白蛋白具有显着的抗氧化活性。此外，蛋氨酸残基也会发生氧化以清除活性氧。Met87、Met123、Met329、Met446 和 Met548 是充当金属螯合剂来中和 ROS 的主要残基 。Met 和 Cys 残基合计占 HSA 抗氧化活性的 40-80%。
6 配体相互作用
配体结合位点是基于HSA的货物运输的主要基础。除了生化和生物物理研究之外，HSA的高分辨率结构和治疗性化合物已经表征了位于IIA、IIIA和IB亚结构域中的3个配体结合位点（图1）。
药物结合位点 1（Sudlow 位点 1）存在于亚结构域 IIA 中。该位点主要是非极性的，具有几组极性残基。一组极性残基存在于该位点的最底部，包括残基 Tyr150、His242 和 Arg257 。第二组位于结合袋的开口处，包含残基 Lys195、Lys199、Arg218 和 Arg222。碱性残基的丰度决定了该位点的配体结合特异性。
药物结合位点 2（Sudlow 位点 2）存在于亚结构域 IIIA 中。该配体结合袋主要是疏水性的，具有特有的静电特征。极性残基存在于结合袋入口的一侧。Arg410、Ser489 和 Lys414 是该位点内与相关配体相互作用的关键残基。
药物结合位点 3存在于亚结构域 IB 中。该位点对内源配体和杂环化合物具有更大的亲和力。Tyr138、Tyr161、Arg141 和 Lys190 是参与配体结合位点的关键残基。
所有这些位点的配体结合亲和力均受到 FA 结合引起的构象变化的影响，FAs 与白蛋白的结合已显示出增加与 Sudlow 位点 1 的结合亲和力，同时降低与 Sudlow 位点 2 的结合亲和力。Sudlow 位点 1 和 2 以及第三个配体结合位点与 FA 结合热点共享氨基酸组成。FA7 结合位点与 Sudlow 位点 1 重叠，FA3 和 FA4 结合位点与 Sudlow 位点 2 重叠 。导致 FA 结合的变构变化可能会影响结合口袋内衬氨基酸的配体相互作用侧链。
HSA 通过与 IB 亚结构域中的第三个药物结合位点相互作用来隔离和运输游离血红素。生理条件下的血红素充当细胞生长和分裂所必需的血红素结合蛋白的辅基。较高水平的血红素会导致ROS的产生，导致氧化应激。血红素还会引起高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的氧化。HSA结合多余的血红素兵引导至其解途径，从而有助于细胞存活。同样，HSA-胆红素复合物可防止培养条件下胆红素毒性导致的细胞死亡。
7 蛋白质相互作用
各种蛋白质相互作用促进白蛋白从细胞外环境摄取到细胞内。这些过程涉及特殊的质膜表面蛋白。这些膜蛋白使用网格蛋白依赖性或动力依赖性内吞过程。FcRn 结合位点存在于白蛋白结构域 III 的 C 端。FcRn 以 pH 依赖性方式与白蛋白结合。定点突变研究表明，HSA 结构域 III 上的三个保守组氨酸残基（H646、H510 和 H535）在 FcRn 结合中发挥着关键作用。FcRn 通过保护白蛋白免遭细胞内降解，将结合白蛋白的半衰期延长至约三周。这些蛋白质相互作用促进培养环境中细胞内白蛋白的运输。从而导致白蛋白结合配体（如金属和FAs）的输入，这些配体对于优化细胞生长和存活至关重要。
8 白蛋白对细胞培养中物理损伤的保护作用
真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，在生物反应器环境中容易受到物理应激的影响。白蛋白可保护生物反应器中的真核细胞损伤。有证据表明，少量使用（1 g/L）白蛋白可以显着减少中试气升式生物反应器或无泡曝气膜生物反应器中哺乳动物细胞培养物中的细胞裂解。白蛋白还与其他添加剂一起使用，例如消泡剂和作为剪切保护剂的普朗尼克酸，以获得最佳效果。现在人们普遍认为白蛋白可能会干扰细胞培养物的理化特性，以防止物理细胞损伤。然而，目前尚不清楚添加剂，尤其是白蛋白等蛋白质如何防止生物反应器环境中的急性致死细胞损伤。
9 白蛋白在生物过程开发中的作用
白蛋白现已完全取代了工业规模生物工艺开发中血清及其衍生物的使用。
1) 它已被证明可以维持生产 IL-2 和其他治疗性蛋白质的生物反应器中的细胞稳定性。
2) 白蛋白用于在杂交瘤细胞培养基中生产抗体。白蛋白支持永生细胞系在培养基中的生长，作为物理剪切保护剂。
3) HSA 还用于干细胞培养应用，以促进人类胚胎干细胞的高度可重复分化。HSA 还促进小鼠胚胎培养物的生长。
4) 白蛋白用于开发用于成纤维细胞培养的无血清培养基。
rHSA非常适合这些应用，因为它满足了临床应用的严格监管要求。
并非所有白蛋白在细胞培养基中都具有相同的功效。蛋白质的纯度和白蛋白相关配体的组成是控制蛋白质作为培养基添加剂的作用的关键因素。与纯化蛋白质相关的配体在很大程度上取决于蛋白质来源（血清或重组体）和纯化过程。这是使用白蛋白作为添加剂的细胞培养物中批次间差异的主要原因。
在 rHSA 中添加稳定剂（例如辛酸）已被证明对特定细胞培养系统具有深远的不利影响。此外，不同的翻译后修饰，包括来自重组或血清来源的HSA的糖化和氧化，会产生显着的批次间差异性。
现代细胞培养基中的白蛋白可以被其他合成或天然替代品取代。水解产物，特别是植物蛋白水解产物，已成功用于替代胚胎培养基中的白蛋白。透明质酸也用于替代人类胚胎移植培养基中的白蛋白。使用聚乙烯醇与氨基酸组合来替代小鼠植入前胚胎培养基中的白蛋白。另一种流行的方法是无蛋白细胞培养基。MEM 和 RPMI-1640 等专有配方不含蛋白质。与含白蛋白培养基相比，无蛋白培养基可以促进更好的细胞生长、更高的蛋白质表达，并促进许多重组蛋白更简单的下游纯化。然而，这些配方通常是细胞系特异性的，需要针对任何给定的培养物进行验证或优化。
10 总结
人血清白蛋白的固有特性使其非常适合生物技术应用，它是真核细胞生长和生存所必需的生物活性成分的重要转运蛋白。白蛋白用于细胞培养，以作为传统使用的血清的替代品。随着杂交瘤培养基、干细胞培养基和组织工程培养基中应用的迅速增长，白蛋白与现代生物工艺开发变得越来越相关。HSA 的高分辨率结构已经确定了配体结合和运输的关键残基，这对于细胞的生长和发育至关重要。高质量无动物源性的重组人白蛋白已经成为细胞培养添加剂的完美选择。
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